Introduction to fluorescence microscopy

• Fluorescence microscopy has significantly evolved since its early applications in the 20th century.
• This technique directly detects fluorescence in the visible spectrum of electromagnetic radiation, unlike other forms of light microscopy that require special optics to enhance contrast.
• Most biomolecules do not naturally fluoresce in the visible region, so extrinsic fluorescent probes are used for studying cellular features with high specificity.

Immunofluorescence

• Immunofluorescence utilizes the high specificity of antibodies to target cellular markers and organelles.
• For cell surface markers, cells are treated with fluorescently labeled antibodies and examined under a microscope.
• For intracellular targets, cells are usually fixed and permeabilized to allow antibody penetration, providing detailed distribution information of the target molecules within the cells.
• This technique is limited to non-living cells due to the need for fixation and permeabilization.

Alternative Approaches

• Small fluorescent dyes can translocate across biological membranes and bind to cellular targets with high specificity.
• Directly labeling molecules with fluorescent tags, such as carboxyfluorescein linked to synthetic peptides, allows for microscopic studies.
• However, direct labeling is not always suitable for specific intracellular molecules.

GFP and Variants

• The discovery of green fluorescent protein (GFP) and its variants has revolutionized protein labeling inside cells.
• GFP can be tagged to either end of a protein, which is crucial for proteins with N-terminal localization signals to maintain proper localization.

Fluorescence Microscope

• An epifluorescence microscope uses a single lens to illuminate the specimen and collect fluorescence light, made possible by the incorporation of a dichroic mirror.
• The microscope features a high-power lamp source, such as a mercury or xenon arc lamp, which provides excitation radiation.
• The dichroic mirror reflects excitation radiation and transmits emitted fluorescence to the ocular lens.

Upright vs. Inverted Microscopes

• In upright microscopes, the objective turret is fixed, and the sample stage moves to focus the image.
• In inverted microscopes, the sample stage is fixed while the objective turret moves, offering better sample manipulation, mechanical stability, and suitability for attaching TIRF accessories.

Autofluorescence

• Many essential cellular molecules, such as B-vitamins, flavins, cytochromes, and nucleotides (FMN, FAD, NADH), are naturally fluorescent.
• Autofluorescence from these molecules is most intense when cells are excited in the UV/blue region and can sometimes be mistaken for specific signal fluorescence.

TIRF

• Total internal reflection fluorescence (TIRF) selectively excites molecules near the slide or culture plate surface, producing fluorescence from a thin sample layer.
• This technique is particularly useful for studying membrane proteins.

Conclusion

• Fluorescence microscopy, including techniques like immunofluorescence and TIRF, is essential in biological research.
• By utilizing fluorescent probes, antibodies, and proteins like GFP, researchers can gain detailed insights into cellular structures and functions.
• Understanding these techniques paves the way for further advancements in scientific research and our comprehension of cellular processes.